Секреты генетической кухни

Специалисты отдела мониторинга состояния лесных генетических ресурсов Центра защиты леса Красноярского края исследуют древесину на клеточном уровне. В их лаборатории помимо различных пробирок, центрифуг, колбочек можно встретить не только микропипетки с дозаторами от 0,5 микролитров.

Чтобы измельчить твёрдые породы, они иногда используют обычную кофемолку, а в холодильник кладут замороженные образцы ДНК: растворённые в воде и подверженные заморозке они могут храниться очень долго. Такая вот молекулярная кухня, об особенностях которой сегодня нам расскажет начальник отдела, кандидат биологических наук Елена Шилкина.

— Елена Алексеевна, меняется ли генетика лесных насаждений? Каковы причины и характер этих изменений?
— Причинами изменения состояния лесных генетических ресурсов служат природные и антропогенные факторы. Под влиянием меняющихся климатических условий происходит освоение новых для вида территорий. Так лиственница сибирская расширила свой ареал на северном пределе распространения, но чаще изменение климатических условий приводит к исчезновению отдельных видов древесных пород, адаптированных только к определённым местообитаниям.

Осваивать новые территории вследствие изменения климата могут не только растения, но и вредные организмы. В результате наблюдается поражение древостоев насекомыми или болезнями, ранее не характерными для данного ареала. Например, массовое распространение уссурийского полиграфа ставит под угрозу существование пихты сибирской как вида.

Определённые виды лесных растений исчезают вследствие массовых рубок. Особенно эта проблема актуальна для тропиков. В Сибири сплошные рубки также оказывают негативное влияние на биоразнообразие. Они способствуют появлению высокой степени инбридинга — скрещивания близкородственных деревьев, которое на практике может служить причиной различных наследственных аномалий, снижению устойчивости популяций. При этом искусственное лесовозобновление вносит гораздо большие изменения в генетическую структуру насаждений, чем естественное, и эти изменения не всегда положительные.

— Как генетические изменения деревьев скажутся на экосистеме в целом?
— В природе всё предельно взаимосвязано. Изменение одного фактора неизменно влечёт за собой целую цепочку других изменений. Прямое наблюдение за этими процессами, их анализ и оценка представляют собой достаточно сложную процедуру, а зачастую и невозможную из-за неоднозначности трактовки полученных результатов.
Древесные организмы играют основополагающую роль в формировании среды обитания большинства видов, обитающих в лесу, поэтому их генетические характеристики имеют значение для всей лесной экосистемы. Внутривидовая генетическая изменчивость преобладающего вида способна оказывать влияние на такие важные процессы, как разложение органики и биогеохимические циклы веществ. Например, установлено, что генетическая изменчивость деревьев в значительной степени влияет на состав почвы, численность насекомых и птиц.

Есть исследования, подтверждающие наличие влияния генетической изменчивости деревьев на потоки углерода и азота в экосистеме и на связь с круговоротом некоторых тяжёлых металлов. Примером служит контролируемое генетически и, таким образом, наследуемое количественное содержание танинов в листьях доминирующего растения, которое влияет на такие процессы экосистемного уровня, как разложение опада и минерализация азота, а также на угнетение патогенов и листогрызущих вредителей.

— Предпринимаются ли какие-то меры, чтобы предотвратить генетическую мутацию? Или в этом нет необходимости?
— Мутации относятся к числу одних из самых непредсказуемых процессов в природе. Они происходят в любой популяции спонтанно, без всякого видимого внешнего воздействия, при этом их частота невелика и оценивается в среднем 105-108 на ген в поколение. Они могут быть полезными и негативными, могут наследоваться, но долгое время не проявляться, будучи рецессивными, или вообще не наследоваться, если носят соматический характер.

В настоящее время вопрос необходимости предотвращения мутаций в популяциях древесных растений остро не стоит. Организмы с вредными и «масштабными» мутациями, как правило, выбраковываются самой природой как менее жизнеспособные. Положительные мутации могут обеспечивать пластичность древесных пород, адаптацию лесных насаждений к меняющимся климатическим и лесорастительным условиям, помогать создавать новые сорта растений. Косвенно в процессе выполнения анализов мы можем увидеть некие генетические особенности растений, которые могли быть стать результатом этого, но мы не можем судить об этом наверняка. Это вопросы фундаментальной науки, мы же выполняем конкретные производственные задачи.

Учёные больше изучают не спонтанные, а индуцированные мутации, которые возникают целенаправленно, путём воздействия рентгеновского облучения, химических веществ и других факторов. Молекулярные биологи работают над генными модификациями, например, с целью создания устойчивости к вредным насекомым. Наиболее распространённым приёмом для этого сейчас является введение в геном растений гена Cry-белка (Bt-токсина) — естественного инсектицида, вырабатываемого почвенными бактериями Bacillus thuringiensis. Такие Bt-защищённые растения начинают вырабатывать Cry-белки для защиты от чешуекрылых и жесткокрылых насекомых-вредителей. Но это я рассказываю с познавательной точки зрения — в задачи нашей деятельности работы по мутагенезу и генным модификациям не входят. К тому же, не совсем понятно, к чему приведут подобные вмешательства.

— Расскажите подробнее о работе вашей лаборатории. Какие исследования здесь проводятся?
— В Российском центре защиты леса в общей сложности 7 отделов мониторинга состояния генетических ресурсов: в Пушкино (Московская область), Воронеже, Барнауле, Санкт-Петербурге, Архангельске, Хабаровске и Красноярске.
Специалисты этих лабораторий следят за изменением структуры основных лесообразующих пород, проводят генетическую «паспортизацию» объектов семеноводства, диагностику возбудителей болезней и вредителей растений, экспертизу происхождения заготовленной древесины для противодействия незаконным рубкам.

В зону ответственности Красноярского филиала входят территории республик Хакасия, Тыва, Томской, Иркутской и Кемеровской областей и частично республики Бурятия.
Ключевая и самая масштабная задача, которая стоит перед нами, — это определение генетической структуры популяций основных лесообразующих пород. Их образцы сначала проходят стадию пробоподготовки, затем из них выделяют ДНК, и уже после этого проводится анализ по ряду генетических параметров.

Изучение проводится с помощью специально подобранных маркеров. Они помогают получить важную информацию как об отдельном дереве, так и о лесном участке в целом. Эти данные вносят в общероссийскую базу, где содержатся сведения об особенностях лесообразующих пород каждого региона. Они используются для мониторинга состояния лесов, оценки биологического разнообразия и, при осуществлении контроля за соблюдением правил лесосеменного районирования, сертификации семян и посадочного материала, а также оборота круглых лесоматериалов.

Другое важное направление работы по лесовосстановлению и сохранению генофонда ценных пород — «генетическая паспортизация».

Ваш паспорт?

— Елена Алексеевна, что вы имеете в виду под термином «генетическая паспортизация»?
— Она заключается в проведении анализа плюсовых деревьев и их вегетативного потомства, представленного в архивах клонов и на лесосеменных плантациях. Специалисты отдела мониторинга проверяют схемы фактического размещения и дают рекомендации по их реорганизации. Информация об изученных участках ДНК, по сути, является своеобразным «паспортом» дерева, удостоверяющим его «личность».
В лаборатории выявляют несоответствия клонов образцам, которые планируется использовать для заготовки семян улучшенного качества.

Их доля при воспроизводстве имеет стратегическое значение — от этого зависит, каким будет лес через ближайшие 50-100 лет. Именно столько времени требуется, чтобы выросли посаженные сейчас деревья. Учитывая огромные временные и денежные затраты, без коих никогда не обходится искусственное лесовосстановление, будет обидно, если посадочный материал сомнительного качества приведёт к плачевным результатам (как с экологической, так и с экономической точки зрения).

— Чем ещё полезны генетические исследования для лесной отрасли?
— С помощью ДНК-анализа можно выявить наличие патогенов в почве при подготовке посадочных площадей, определить истинные границы очага инфекции и установить источник инфицирования (вода, почва, растительные остатки и так далее).

Генетические технологии позволяют проводить прямой анализ инфицированных тканей растений, осуществлять раннюю диагностику болезней и насекомых с высокой точностью и в сжатые сроки, когда нанесённый ими ущерб ещё минимален, а проведение профилактических мероприятий даёт максимальный эффект.

Знать врага в лицо

— Бывает ли так, что с помощью ДНК-анализов удаётся установить возбудителей болезней, которые раньше оставались незамеченными?
— Результаты ДНК-диагностики фитопатогенов, проводимой с 2014 по 2018 годы, на территории 28 лесных питомников Красноярского края и республики Хакасия на общей площади более 480 га помогли выявить много нового.

Специалисты изучили микрофлору сеянцев сосны обыкновенной, ели сибирской и сосны кедровой сибирской 1-6-летнего возраста и благодаря молекулярно-генетическому анализу обнаружили 12 родов патогенных и условно-патогенных микроскопических грибов, вызывающих болезни хвойных деревьев.

---

Генетический метод анализа эффективен при сборе доказательств по факту незаконных рубок

---

Некоторые из них ранее не диагностировались или отмечались крайне редко. К их числу относятся фомоз, тифулез, склерофомоз, эпикоккоз, склеродерриоз.

ДНК-анализ расширил возможности для исследования видового разнообразия грибов и изменил представления о видах, доминирующих в патологическом процессе.

По данным молекулярно-генетической диагностики, основными болезнями сеянцев в питомниках Красноярского края и Хакасии в первые два года жизни являются фомоз, альтернариоз, кладоспориоз и ризоктониоз, а 3-6-летних саженцев — фомоз, настоящее и обыкновенное шютте, склерофомоз, фацидиоз и снежная плесень.

---

Древесные организмы играют основополагающую роль в формировании среды обитания большинства видов, живущих в лесу, поэтому их генетические характеристики имеют значение для всей лесной экосистемы

---

Остальные заболевания встречаются реже, не во всех питомниках и, скорее, относятся к категории случайных, появление которых чаще всего связано с нарушением агротехники. Полученные данные требуют пристального внимания со стороны практиков лесного питомнического хозяйства, а также представляют интерес для науки в разрезе изучения патогенных свойств грибов-возбудителей болезней и разработки эффективных препаратов для борьбы с ними.

За последние несколько лет получено много сведений по ДНК-диагностике грибов корневая губка и ризина волнистая. Корневая губка не случайно считается одним из самых опасных и трудно диагностируемых возбудителей заболеваний хвойных пород. Предполагается, что реальные размеры экономического ущерба значительно превышают статистические данные. В естественных условиях обильное образование плодовых тел корневой губки встречается редко, но молекулярно-генетический анализ с применением видоспецифичных маркеров позволяет быстро идентифицировать присутствие гриба в корнях и почве вне зависимости от наличия плодовых тел. Это даёт возможность принять своевременные меры для оздоровления и сохранить товарные качества древесины.

До недавнего времени не предполагалось, что к такому распространённому явлению, как гибель саженцев в первый-второй год на участках восстановления леса после пожаров, имеет отношение гриб ризина волнистая. Его роль в данном процессе ранее не была достаточно исследована и оценена. ДНК-диагностика достоверно показала наличие генетического материала этого гриба в почве 50-95% случаев гибели саженцев при их посадке на свежих гарях. Полученные данные позволили сделать вывод о нецелесообразности такого лесовосстановления.

Лесная «криминалистика»

— Елена Алексеевна, вы сказали, что одна из задач вашей лаборатории — экспертиза заготовленной нелегально древесины. Как это происходит?
— Существует несколько методов. Нужно взять образцы ДНК с пней на нелегальной лесосеке и брёвен, а потом сравнить результаты. Таким образом удастся установить, есть ли идентичные образцы, принадлежавшие одному дереву.

Опыт успешной экспертизы древесины для сбора доказательств по факту незаконной рубки у отдела генетики уже есть, и перспективы использования ДНК-анализа в данном направлении всё более очевидны. Такая работа впервые была проведена в Томской области, и в случае успешного использования полученных результатов в раскрытии преступления, эта практика будет распространена на другие регионы.
Преимущества генетических методов заключаются в высокой точности и скорости исполнения. Недостаток заключается в сложности определения пространственной генетической структуры популяции и трудностях извлечения ДНК из древесных образцов. Этот процесс трудоёмок из-за механической твёрдости ткани. Кроме того, есть ингибиторы среди химических составляющих древесины и биологических «загрязнителей» в виде чужеродной ДНК микроорганизмов, грибов и так далее. Сложности возникают с выделением нуклеиновых кислот после термо- и химической обработки, а иногда это и вовсе невозможно.

Часто возникают вопросы по факту обоснованности назначения санитарных рубок. Если они были назначены по причине болезней леса, здесь тоже может быть полезна генетическая экспертиза. Она даёт точное заключение по видовому составу возбудителей заболеваний в образцах древесины, полученных с мест проведения санитарно-оздоровительных мероприятий и способна подтвердить или опровергнуть правильность назначения мероприятия.

Для анализа подойдут фрагменты пней, корни, порубочные остатки, хвоя — из них выделяют ДНК фитопатогенов и сравнивают с данными лесопатологического обследования.